微流控芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期建立起來(lái)的一種新的微型化快速分析平臺(tái)，它是通過(guò)微細(xì)加工技術(shù)在芯片上構(gòu)建由儲(chǔ)液池、微反應(yīng)室、微管道等微功能元件構(gòu)成的微流路系統(tǒng)，加載生物樣品和反應(yīng)液后，在壓力泵或者電場(chǎng)作用下形成微流路，于芯片上進(jìn)行一種或連續(xù)多種的反應(yīng)，達(dá)到對(duì)樣品高通量快速分析的目的。微流控芯片的加工方法有很多種，傳統(tǒng)的微流控芯片是以硅片作為基底材料，通過(guò)光刻技術(shù)高精密度地復(fù)制二維圖形，這種方法可以獲得高精密度的微流控芯片，但是光刻技術(shù)存在對(duì)加工環(huán)境要求高、加工成本高以及加工周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以聚甲基丙烯酸甲酯為基底材料，通過(guò)CO2激光直接加工的方法制備微流控芯片，并用于免疫分析。
    1  實(shí)驗(yàn)方法
    1.1  儀器與試劑PMMA（上海天進(jìn)塑膠制品有限公司）、CO2激光器（洛陽(yáng)天方設(shè)備有限公司）、BPCL-2-KGC微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x及分析軟件（中科院生物物理研究所）、HL-2恒流泵（上海滬西分析儀器公司）、羧基磁珠（山東滋博赫茲生物公司）、AFP抗體（武漢博士德公司）、AFP 標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的AFP抗體（深圳晶美公司）、魯米諾（Sigma）。
    1.2  激光加工裝置的構(gòu)建  激光加工裝置主要由計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)、開(kāi)關(guān)電源、冷卻水循環(huán)、CO2激光器和光學(xué)光路、電路系統(tǒng)6個(gè)部分組成。其結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。CO2激光器購(gòu)自洛陽(yáng)天方設(shè)備有限公司，激光的波長(zhǎng)10.6um，輸出功率0~50W，工作模式是連續(xù)運(yùn)行。在本系統(tǒng)中，激光器固定，激光器產(chǎn)生的激光通過(guò)聚焦棱鏡聚焦在芯片基底上，將設(shè)計(jì)的微流路CAD圖形轉(zhuǎn)換成準(zhǔn)分子激光微加工系統(tǒng)可識(shí)別的指令，通過(guò)工作臺(tái)的運(yùn)動(dòng)來(lái)完成芯片加工。聚焦透鏡的焦距是20mm。采用北京新立龍軟件有限公司的新立龍軟件對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行控制。

     1.3.1  基片的清洗   根據(jù)所設(shè)計(jì)的芯片大小，截取一定面積的PMMA基片，放置于裝有三蒸水的玻璃燒杯中，置于超聲清洗器中進(jìn)行清洗，一共清洗3次，每次清洗5min，以除掉PMMA基片表面黏附的灰塵和其他雜質(zhì)。清洗完成后，用高純N2流吹干。
     1.3.2  激光加工   采用三維輔助設(shè)計(jì)軟件（AutoCAD）設(shè)計(jì)微流路圖形，將洗凈的PMMA基片放置于激光加工裝置的固定平臺(tái)上，打開(kāi)激光加工裝置的電源，打開(kāi)激光器的冷卻循環(huán)水電源，設(shè)置好激光器的強(qiáng)度和激光的掃描速度，將設(shè)計(jì)的微流路CAD圖形轉(zhuǎn)換成準(zhǔn)分子激光微加工系統(tǒng)可識(shí)別的指令，采用激光微加工系統(tǒng)在聚甲基丙烯酸甲酯基片表面獲得微流路，采用同樣的方法加工具有進(jìn)樣口和出樣口的芯片蓋片。
     1.3.3  微流控芯片的表面修飾   將加工好的芯片在異丙醇溶液超聲清洗，然后用160g/L的氫化鋁鋰乙醚溶液對(duì)通道表面進(jìn)行處理30min，處理完成后再分別用異丙醇和三重蒸餾水進(jìn)行超聲清洗，用高純N2流吹干。
     1.3.4  熱壓鍵合   將處理好的芯片與基片置于熱壓裝置兩片玻璃片之間，放入簡(jiǎn)易熱壓裝置，壓緊，88~95攝氏度，1.0~1.4壓力下熱鍵合30min獲得完整的芯片。
    1.4  微流控芯片用于免疫分析的研究" 將加工好的微流控芯片及其與其相連的外部管道置于一密封艙內(nèi)，以恒流泵控制管道內(nèi)流體的流動(dòng)。以甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）為檢測(cè)對(duì)象，采用雙抗夾心免疫分析法進(jìn)行檢測(cè)，以超順磁珠作為固化抗體的載體，電磁場(chǎng)控制超順磁珠的吸附與釋放，以辣根過(guò)氧化物酶-魯米諾化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯示免疫反應(yīng)。信號(hào)檢測(cè)處理系統(tǒng)采用BPCL-2-KGC微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x對(duì)免疫反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)進(jìn)行放大及分析。
    2  實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    2.1  激光加工強(qiáng)度與激光加工次數(shù)對(duì)微流控芯片通道的影響
    2.1.1  芯片通道深度與激光強(qiáng)度的關(guān)系  在其他條件不變的情況下，改變激光強(qiáng)度觀察通道深度變化的情況，在加工過(guò)程中激光強(qiáng)度達(dá)到5W時(shí)才開(kāi)始在PMMA材料上燒蝕出條紋，以后隨著激光束強(qiáng)度的增加，通道深度也隨著線性增加（圖2）。

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    2.1.2  芯片通道深度與激光加工次數(shù)的關(guān)系  我們將激光強(qiáng)度固定在25W，觀察芯片通道深度的變化。在激光強(qiáng)度固定不變的情況下，芯片通道深度隨著激光加工次數(shù)的增加而增加（圖3），由于激光加工速度很快，流道很窄，激光加工過(guò)程中氣化的材料沒(méi)揮發(fā)出去又重新凝結(jié)在壁面，因此芯片通道深度并不是隨著激光加工的次數(shù)而成倍增長(zhǎng)。
    2.1.3  氫化鋁鋰對(duì)通道的修飾作用   采用激光微加工PMMA獲得的芯片通道表面比較不平整度較大，通道壁黏附有PMMA氣化以后留下的殘?jiān)�，必須要�?duì)通道進(jìn)行處理。首先將加工好的芯片放于裝有三重蒸餾水的玻璃燒杯中進(jìn)行超聲清洗，一共需要超聲清洗3次，以除掉通道壁黏附的殘?jiān)�。然后在微通道中加�?60g/L的氫化鋁鋰乙醚溶液，氫化鋁鋰與PMMA發(fā)生劇烈反應(yīng)，產(chǎn)生大量的氣泡，隨后在通道內(nèi)有大量的白色沉淀生成，進(jìn)行超聲清洗后在體視顯微鏡下可以觀察到通道表面的不平整度降低了，說(shuō)明氫化鋁鋰對(duì)通道表面有鈍化作用（圖4）

    2.2  微流控芯片用于免疫分析的研究   我們采用該系統(tǒng)對(duì)AFP進(jìn)行了雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光免疫分析，圖5是AFP濃度分別為0、10、20、40、60、80、100ng/mL 時(shí)用該系統(tǒng)測(cè)得的化學(xué)發(fā)光曲線。在去除試劑空白后，以AFP 濃度為橫坐標(biāo)，各濃度AFP化學(xué)發(fā)光曲線的積分值為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：AFP濃度（ ng/mL）=化學(xué)發(fā)光積分值*3.64X10*-6-0.22，相關(guān)系數(shù)為O.998，表明該系統(tǒng)可以用于免疫分析。